بررسی فعالیت acc دآمیناز در ازتوباکترهای بومی و انتقال ژن acds از سودوموناس فلورسنس به ازتوباکتر منتخب

یکی از مکانیسم های باکتری های ریزوسفری محرک رشد گیاه (pgprs) برای تحریک رشد گیاهان از طریق فعالیت آنزیم 1-آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسید (acc) دآمیناز می باشد. باکتری های حاوی این آنزیم، با تجزیه پیش ماده اتیلن گیاهی (acc)، غلظت آن را در گیاه در حال رشد و یا تحت تنش کاهش داده و در نتیجه گیاه را در مقابل اثرات مضر ناشی از سطوح بالای اتیلن (اتیلن تنشی) حفظ می کنند. اگر چه بسیاری از گونه های ازتوباکتر رشد گیاهان را تحریک می کنند، اما با وجود این، تاکنون گزارشی دال بر تولید آنزیم acc دآمیناز توسط اعضای این جنس وجود ندارد. بنابراین، برای اثبات این موضوع در وهله اول، تعدادی از ایزوله های ازتوباکتر بومی از خاک های تحت کشت گندم و جو مناطق مختلف (محیط های تحت تنش خشکی و شوری) اطراف تبریز، جداسازی، خالص سازی و شناسایی شدند و از نظر acc دآمیناز بطریق بیوشیمیایی و مولکولی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج حاصله حاکی از عدم وجود و فعالیت آنزیم acc دآمیناز در سویه های مورد مطالعه بود. بنابراین در وهله بعدی، به منظور ارتقا خصوصیات pgprی ازتوباکتر، اقدام به انتقال ژن کد کننده acc دآمیناز (acds) به سویه بومی منتخب ازتوباکتر گردید. برای انجام اینکار، ابتدا چندین سویه باکتری سودوموناس بومی با فعالیت acc دآمینازی جداسازی و خالص سازی گردید. سپس با استفاده از تکنیک pcr، ژن acds از یک سویه سودوموناس بومی با فعالیت acc دآمینازی بالا (pseudomonas fluorescens strain fy32) تکثیر گردید. بررسی های بیشتر نشان داد که این ژن جایگاه پلاسمیدی داشته و در یک پلاسمید حدود kbp50(pfy32) قرار دارد. یکسانی در الگوی برش آنزیمی ژن acds حاصل از pcrی dnaکل و پلاسمیدی این باکتری و نیز با انتقال pfy32 به سویه dh5? باکتری escherichia coli این موضوع اثبات گردید. سپس ژن acds تکثیر شده در یک وکتور مناسب (pbluescript ii ks-) کلون (pbkacc1) و توالی یابی گردید. آنالیز ژنی به ترتیب 94 و 98 درصد شباهت در سطح اسید نوکلئیک و پروتئین با توالی acds باکتری pseudomonas sp. 6g5 نشان داد. همچنین، رسم درخت فیلوژنی توالی های acds موجود و مقایسه آن با درخت فیلوژنی توالی های 16s rrna متناظر، حاکی از انتقال افقی ژن در داخل اعضای یک رده بود. سپس با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی biac f, azbacr و نیز biac f, r و pbkacc1 بعنوان الگو، دو واکنش pcr دیگر انجام، و محصولات آن بترتیب در وکتورهای pbluescript ii ks- و pbr322 کلون شده (بترتیب pbkacc2 و pbracc) و سپس در پلاسمیدهای(+)pet28a و pbi121 بترتیب تحت کنترل پروموترهای t7 و camv 35s ساب کلون گردیدند و نهایتاً پلاسمیدهای نوترکیب pet28acc و pbiacc که قابلیت بیان ژن acds را دارا بودند، ساخته شدند. به منظور بیان سیتوپلاسمی ژن acds، انتقال پلاسمید pbiacc به باکتری azotobacter vinelandii fy10 بومی منتخب از طریق الکتروپوریشن انجام شد. در ترانسفورمانت حاصله، بیان و فعالیت آنزیم acc دآمیناز با روش اندازه گیری کمی تائید شد. همچنین پایداری پلاسمید انتقالی در باکتری نوترکیب حاصله طی 10 کشت متوالی با کشت های مکرر در محیط کشت های بدون آنتی بیوتیک حاکی از پایداری بسیار بالای این پلاسمید بود. ارزیابی تاثیر تلقیح سویه باکتری تراریخت روی گیاه گندم حاکی از اثر مثبت و معنی دار آن بر وزن تر ریشه و بخش هوایی بترتیب در مقایسه با سویه وحشی و شاهد بدون تلقیح بود. این اولین گزارش در مورد انتقال و بیان آنزیم acc دآمیناز بعنوان یک خصوصیت pgprای دیگر ازتوباکتر می باشد.